Biomedicinske ingeniører ved Duke University har brugt en CRISPR/Cas9 genteknologi til at slukke for et gen, der regulerer kolesterolniveauet i voksne mus, hvilket fører til reducerede kolesterolniveauer i blodet og genundertrykkelse, der varer i seks måneder efter en enkelt behandling.
Dette er første gang, forskere har leveret CRISPR/Cas9-repressorer til målrettet terapeutisk gendæmpning i voksne dyremodeller. Undersøgelsen blev vist online i Nature Communications den 26. april.
CRISPR/Cas9-systemet er baseret på en antiviral forsvarsmekanisme i bakterier, hvor Cas9-enzymet genkender de virale DNA-sekvenser fra tidligere infektioner og skærer invaderende DNA op under geninfektion. Forskere har konstrueret CRISPR/Cas9-systemet til ikke kun at lokalisere og skære specifikke sekvenser af DNA, men også til at tænde eller slukke for ekspressionen af målrettede gener uden at foretage permanente ændringer i DNA-kodende sekvens.
Mens denne CRISPR/Cas9-repressorteknik er dukket op som et robust værktøj til at forstyrre genregulering i cellekulturmodeller, var den endnu ikke blevet tilpasset til levering til voksne dyr til anvendelser såsom genterapi.
I deres seneste undersøgelse udviklede Charles Gersbach, Rooney Family Associate Professor of Biomedical Engineering ved Duke, og medlemmer af hans laboratorium en tilgang til effektivt at pakke og levere CRISPR/Cas9-repressorsystemet til mus. De testede deres leveringssystem ved at dæmpe Pcsk9, et gen, der regulerer kolesterolniveauet. Mens adskillige lægemidler er blevet udviklet til at behandle højt kolesteroltal og hjertekarsygdomme ved at blokere aktiviteten af Pcsk9, ville denne nye tilgang forhindre Pcsk9 i at blive fremstillet.
"Vi brugte tidligere de samme typer værktøjer til at tænde og slukke for gener i dyrkede celler, og vi ville se, om vi også kunne levere dem til dyremodeller med en tilgang, der er relevant for genterapi," Gersbach sagde. "Vi ønskede at ændre generne på en måde, der ville have et terapeutisk resultat, og Pcsk9 er et nyttigt proof-of-concept i betragtning af dens rolle, der regulerer kolesterolniveauer, som igen påvirker sundhedsproblemer som hjertesygdomme."
For at teste den målrettede Pcsk9-repressor i et voksent dyr, valgte holdet at bruge adeno-associerede virale (AAV) vektorer - små vira, der er blevet konstrueret til at målrette en række forskellige vævstyper i kliniske forsøg med human genterapi. På grund af vektorens lille lastgrænse kunne holdet ikke bruge det almindelige Cas9-enzym fra Streptococcus pyogenes. I stedet valgte de at bruge en mindre Cas9 fra Staphylococcus aureus. De deaktiverede også den DNA-skærende funktion af Cas9, hvilket skabte en "død" version af enzymet, dCas9, der binder til, men ikke skærer den målrettede DNA-sekvens.
dCas9 kan kombineres med et KRAB-protein, der dæmper genekspression, hvilket skaber en CRISPR/Cas9-repressor, der blokerer transkription, reducerer kromatintilgængelighed og dæmper genekspression uden at ændre den underliggende DNA-sekvens. Ved at bruge en adenovirusvektor til at levere CRISPR/Cas9-baserede repressorer til museleveren reducerede forskerne Pcsk9- og kolesterolniveauer i behandlede mus.
Mens eksperimentet var vellykket, observerede forskerne også frigivelse af leverenzymer i blodet kun i behandlinger, der omfattede Cas9. Mens disse leverenzymniveauer forblev under en kritisk tærskel og normaliserede sig over tid, indikerede deres forhøjede niveauer, at terapien potentielt forårsagede immunreaktioner i leveren, hvor virussen og Cas9-enzymet akkumuleres. Det rejser spørgsmål om effektiviteten af flere injektioner.
"En af de interessante ting, vi fandt, lignede et immunrespons mod Cas9-proteinet," sagde Pratiksha Thakore, den ph.d.-studerende, der ledede arbejdet i Gersbachs laboratorium. "Efter injektionen så vi, at niveauerne af vores målgen, Pcsk9, blev reduceret, men vi observerede også stigninger i ekspressionen af mange immuncellers gener, hvilket indikerer, at immunceller infiltrerede leveren, efter at vi havde leveret Cas9 til musene. bedre forståelse af dette immunrespons og hvordan man modulerer det, vil være vigtigt for at bruge Cas9-teknologier til terapier."
Når forskere udvikler nye måder at bruge CRISPR/Cas9 til terapi og forskning, dukker der mere information op om, hvordan immunsystemet hos levende organismer reagerer på levering af CRISPR/Cas9-systemet. Fordi Cas9-enzymet er afledt af bakterier, kan immunsystemet genkende det som et fremmed protein fra en invaderende organisme og igangsætte et respons. Der er også bekymring for, at potentielle patienter til en CRISPR/Cas9-baseret behandling allerede kan være klar til at rumme immunresponser mod disse systemer, fordi de Cas9-enzymer, der oftest bruges i forskning, kommer fra almindelige bakterier, som mennesker rutinemæssigt udsættes for.
"Feltet er lige begyndt at se på dette, og det er klart, at immunrespons er et vigtigt emne," sagde Gersbach. "Selvom vi så et immunrespons i musene, da vi administrerede Cas9, syntes niveauerne af leverenzymer i serum at aftage over tid uden nogen indgriben, og virkningen af Pcsk9-undertrykkelse blev opretholdt uanset."
Mens de fortsætter forskningen, håber Gersbach og hans samarbejdspartnere at indsamle mere information for bedre at forstå immunresponset mod Cas9 og stabiliteten af epigenetisk modulation.
"Der er stadig mange ting for os at udforske med denne tilgang," sagde Thakore. "CRISPR/Cas9-værktøjer har fungeret så godt i cellekulturmodeller, at det er spændende at anvende dem mere in vivo, især når vi undersøger vigtige terapeutiske mål og bruger leveringsmidler, der ville være relevante til behandling af menneskelige sygdomme."
